Агар Мюллера-Хинтона II

Представляємо Вашій увазі агар мюллера-хинтона ii від відомого виробника в галузі готові поживні середовища - Biolife Italiana S.r.l., країна виробник - Італія.

Принцип методу і пояснення процедури

Розвиток бактеріальної резистентності до протимікробних препаратів в першій половині XX століття призвів до того, що лікарям довелося звертатися в мікробіологічну лабораторію з проханням протестувати патоген пацієнта проти різних концентрацій даного протимікробного препарату для визначення сприйнятливості або резистентності до цього препарату 1.

Вільям М. М. Кірбі та його колеги запропонували одно-дисковий метод тестування чутливості до протимікробних препаратів, а потім Кірбі і Бауер, ретельно вивчивши літературу з тестування сприйнятливості, об'єднали і оновили всі попередні описи диско-дифузійного методу і опублікували свої результати 2.

Ця публікація спонукала Всесвітню Організацію Охорони Здоров'я сформувати комітет в 1961 році, щоб закласти основу для розробки певної процедури одно-дискового тестування чутливості до протимікробних препаратів.

Результатом стала стандартизована процедура тестування на диско-дифузійну сприйнятливість, відтепер спочатку звана тестом Андерсона, а потім диско-дифузійним тестуванням Кірбі-Бауера 3. Живильним середовищем, запропонованим для методу Кірбі-Бауера, був Агар Мюллера-Хінтона, спочатку розроблений Говардом Мюллером і Джейн Хілтон в 1941 році для виділення гонококів і менінгококів.4

В даний час Інститут клінічних лабораторних стандартів (CLSI) для США та Європейський комітет з тестування чутливості до протимікробних препаратів (EUCAST) для Європи відповідають за оновлення та модифікацію оригінальної процедури в рамках процесу глобального консенсусу.5,7 Агар Мюллера-Хінтона вважається найкращим середовищем для тестування чутливості до протимікробних препаратів і рекомендується як CLSI5, так і EUCAST6. Він вважається придатним для використання і стандартизований EUCAST для тестування найбільш поширених швидкозростаючих бактерій: Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Aeromonas, Burkolderia pseudomallei.6 Спостерігалися відмінності в характеристиках Агару Мюллера-Хінтона між партіями / серіями виробників з різних причин. Концентрація двовалентних катіонів Mg++ і Ca++ впливають на сприйнятливість Pseudomonas spp. до тетрацикліну, гентаміцину, поліміксину В і карбеніциліну10; концентрація кальцію змінює зони інгібування даптоміцину грампозитивними бактеріями 11.

Зміна вмісту тиміну і тимідину впливає на значення сульфонаміду і триметоприму.12,13. Концентрація цинку впливає на інтерпретацію резистентності карбапенемів проти P. aeruginosa.14, а рівень марганцю впливає на інтерпретацію резистентності тігецикліну проти Enterobacteriaceae і A. baumannii.15 Агар Мюллера-Хінтона II Biolife показує непогану відтворюваність від партії до партії для проведення тестів на чутливість, він має низький вміст сульфонаміду і триметоприму, інгібіторів (тиміну і тимідину), підтримує задовільний ріст грампозитивних і грамнегативних не вибагливих патогенів, містить контрольовані і скориговані рівні кальцію, магнію і цинку, щоб гарантувати оптимальні зони інгібування в межах діапазону контролю якості..

В ході оцінки EUCAST9 21 марки середовища Мюллера-Хінтона, Агару Мюллера-Хінтона II Biolife і п'яти інших марок продемонстровано відмінні показники з ≥99% показань діаметра зони в межах діапазону контролю якості (QC) і ≥70% на цільовому ±1 мм.

Фізичні властивості

• Вигляд середовища блідо жовте, прозоре Кінцевий pH при 20-25 °C 7.3 ± 0,1
• Глибина агару 4.0 ± 0,5 мм

Матеріали що потрібні, але такі, що не надаються

Стерильні петлі і тампони, інкубатор і лабораторне обладнання в міру необхідності, чутливі до антимікробних препаратів паперові диски.

Зразки

АSТ диско-дифузійним методом призначене для використання з чистою культурою штамів, виділених з клінічних зразків.

Агар Мюллера-Хінтона II не призначений для виділення мікроорганізмів безпосередньо з клінічних зразків.

Для вибору відповідних антимікробних засобів для тестування потрібно фарбування по Граму і попередня бактеріальна ідентифікація.

EUCAST опублікувала метод швидкого АSТ (зчитування при 4, 6 або 8 годинах інкубації) безпосередньо з позитивних посівів крові у пробірках, затверджених для обраних організмів; зверніться до документа EUCAST відносно інформації щодо процедури тестування, зчитування та інтерпретації зон інгібування.16

Процедура тестування

Описана тут процедура тестування, а також зчитування та інтерпретація зон інгібування є коротким викладом документів EUCAST.

• Поверхня агару повинна бути сухою перед використанням. Краплі води не повинні бути видні на поверхні агару або всередині кришки. При необхідності висушіть планшети або при температурі 20-25 °С протягом ночі, або при температурі 35 °С, знявши кришку, протягом 15 хв.
• Використовуйте стерильну петлю або ватний тампон для збору колоній з нічної культури на неселективних середовищах. Використовуйте кілька морфологічно подібних колоній (коли це можливо), щоб уникнути вибору атипового варіанту. Суспендуйте колонії у фізіологічному розчині і перемішайте до рівномірного помутніння. Відрегулюйте щільність суспензії організму до 0,5 McF, додавши фізіологічний розчин або більше бактерій. Суспензію завжди слід використовувати протягом 60 хв після приготування.
• Опустіть стерильний ватний тампон в суспензію. Щоб уникнути надмірної інокуляції грамнегативних бактерій, видаліть зайву рідину натисканням і повертаючи тампон до внутрішньої сторони пробірки. Щодо грампозитивних бактерій, не притискайте і не повертайте тампон до внутрішньої сторони пробірки.
• Планшети можна інокулювати або тампонуванням в трьох напрямках, або за допомогою автоматичного обертача планшетів. Рівномірно розподіліть інокулят по всій поверхні агару, стежачи за тим, щоб між штриховими смугами не було зазорів.
• Перед відкриттям картриджів або контейнерів, що використовуються для зберігання дисків, дайте дискам нагрітися до кімнатної температури.
• Щільно прикладіть диски до поверхні інокульованого планшету з агаром протягом 15 хвилин після інокуляції. Диски повинні знаходитися в тісному і рівномірному контакті з поверхнею агару і не повинні переміщатися після нанесення, так як початкова дифузія антимікробних агентів з дисків відбувається дуже швидко.
• Кількість дисків на планшеті повинна бути обмежена, щоб уникнути перекриття зон і перешкод між агентами. Важливо, щоб діаметри зон можна було надійно виміряти. Максимальна кількість дисків залежить від організму і вибору дисків. Зазвичай, 6 і 12 дисків - це максимально можливе число на круглому планшеті діаметром 90 і 150 мм відповідно.
• Для виявлення індукованої резистентності до кліндаміцину у стафілококів і стрептококів, еритроміцинові і кліндаміцинові диски повинні розташовуватися на відстані 12-20 мм від краю до краю для стафілококів і 12-16 мм від краю до краю для стрептококів.
• Переверніть планшети з агаром і переконайтеся, що диски не падають з поверхні агару. Інкубуйте пластини протягом 15 хв після нанесення диска. Якщо планшети залишити при кімнатній температурі після нанесення дисків, попередня дифузія може призвести до помилково великих зон інгібування.
• Інкубувати при температурі 35 ± 1 °C у повітряному середовищі протягом 18 ± 2 год (24 год для глікопептидів і Enterococcus).

Умови зберігання і термін придатності

Після отримання планшетів, зберігайте їх в оригінальній упаковці при температурі 2-8 °C далеко від прямого світла.

При правильному зберіганні планшети можна використовувати до закінчення терміну придатності. Не використовуйте планшети після цієї дати. Планшети з розкритого пластикового саше можна використовувати протягом 7 днів при зберіганні в чистому приміщенні при температурі 2-8 °С. .

Не використовуйте планшети, якщо пластиковий пакетик-саше пошкоджений або якщо планшет розбитий. Не використовуйте планшети з ознаками псування (наприклад, мікробне забруднення, зневоднення, усадка або розтріскування середовища, нетиповий колір, надлишок вологи).

Зняття показників та інтерпретація

Після інкубації зчитайте показники планшетів зі зворотного боку відбитим світлом, тримаючи планшети над темним фоном.

Правильний інокулят і задовільно проштриховані планшети повинні привести до «газону» зростання що зливається. Якщо окремі колонії видно, то щеплення занадто легке, і тест необхідно повторити. Зростання повинне бути рівномірно розподілене по поверхні агару для досягнення рівномірно круглих (не зазубрених) зон інгібування. Переконайтеся, що зони інгібування для штамів контролю якості знаходяться в допустимих межах

Для всіх агентів край зони повинен бути зчитаний в точці повного гальмування, про що можна судити неозброєним оком, коли планшет знаходиться приблизно в 30 см від ока. Утримання планшету під кутом 45 градусів до робочого столу може полегшити читання, коли краї зони важко визначити.

Виміряйте діаметри зон гальмування з точністю до міліметра лінійкою або штангенциркулем. Для отримання конкретних інструкцій з читання зверніться до документа EUCAST.6

Інтерпретуйте діаметри зон у категорії сприйнятливості відповідно до поточних таблиць точок зупинки.7

Контроль якості користувача

Всі вироблені партії планшетів Агару Мюллера-Хінтон II випускаються в продаж після проведення контролю якості на відповідність технічним вимогам відповідно до правил EUCAST 6,17.

Однак, кінцевий користувач несе відповідальність за проведення випробувань з контролю якості відповідно до місцевих застосовних нормативних актів, відповідно до вимог акредитації та досвіду лабораторії.

Використовуйте штами контролю якості, зазначені EUCAST і підсумовані тут нижче, щоб контролювати ефективність тестування.

Основні рекомендовані контрольні штами є типовими сприйнятливими штамами, але резистентні штами також можуть бути використані для підтвердження того, що метод буде виявляти резистентність, опосередковану відомими механізмами резистентності.

Переконайтеся в тому, що результати для контрольних штамів знаходяться в межах допустимих діапазонів в таблицях контролю якості EUCAST.17

• Escherichia coli ATCC 25922 - чутливі, «дикі»
• Escherichia coli ATCC 35218 TEM-1 β-лактамаза, стійка до ампіциліну (для контролю інгібіторного компонента комбінації дисків «β-лактам-інгібітор»)
• Klebsella pneumoniae ATCC 700603 Штам-продуцент ESBL (SHV-18) (для контролю інгібіторного компонента комбінації дисків «β-лактам-інгібітор)
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - чутливі, «дикі»
• Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-2814 KPC-3, SHV-11 і TEM-1
• Staphylococcus aureus ATCC 29213 - слабкий продуцент β-лактамази
• Enterococcus faecalis ATCC 29212 - чутливі, «дикі».
• Staphylococcus aureus NCTC 12493 - mecA+, стійкість до метициліну (MRSA)
• Enterococcus faecalis ATCC 51299 - HLAR, vanB+ Високий рівень резистентності до аміноглікозидів (HLAR) і ванкоміцину (vanB-позитивний)

ATCC є торговою маркою Американської колекції типових культур; NCTC є торговою маркою Національної колекції типових культур

Для отримання детальної інформації про вибір антибіотиків, контрольні штами, частоту контролю та таблиці діапазонів прийнятності зверніться до документів EUCAST.6,17

Експлуатаційні характеристики

Перед випуском у продаж репрезентативний зразок всіх партій готових до вживання планшетів Агару Мюллера-Хінтона II 90 мм і 150 мм і сировини, що використовується для виробництва підготовлених планшетів (зневоднений Агар Мюллера-Хінтона II REF 401740), тестують методом антимікробної чутливості, на продуктивність властивостей і методом визначення Ca++ ad Mg++ , шляхом порівняння результатів з раніше схваленою еталонною партією.

Продуктивність тестують напівкількісним екометричним методом з наступними цільовими штамами: E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923 і P. aeruginosa ATCC 27853.

Після аеробної інкубації при температурі 35-37 °С протягом 18-24 годин кількість росту оцінюють і реєструють. Всі штами повинні показувати хороший ріст. АSТ здійснюється згідно процедурі EUCAST6 з використанням наступних штамів і антимікробних дисків: E.faecalis ATCC 29212: TRS, DAP (Etest), CIP; E.coli ATCC 35218: AMS, PIT; E.coli ATCC 25922: AMI, AMC, AMP, CTZ, CXI, CTA, CIP, CHL, GEN, IMI, TRS; S.aureus ATCC 25923: APM, CHL, CIP, CLI, ERY, GEN, LIN, BEN, QUD, TET; P.aeruginosa ATCC 27853: AMI, AZT, CEP, CTZ, CIP, GEN, IMI, PIT, TOB..

Після інкубації зони інгібування вимірюються, реєструються і оцінюються в межах діапазонів контролю якості, повідомлених EUCAST і/або CLSI.5,17 Концентрація Ca++ і Mg++ вимірюється для всіх виробничих партій зневодненої сировини Агару Мюллера-Хінтона II, щоб забезпечити відтворюваність від партії до партії.

Протягом 2018-2019 років EUCAST оцінювала ефективність 21 міжнародної марки зневодненого Агару Мюллера-Хінтона від 17 виробників. 9

Тестування включало 4 тест-штами (E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212) і 18 антимікробних дисків, обраних для представлення різних класів агентів і включення агентів, які могли б виявити ефекти зміни рН і вмісту катіонів і тимідину. Всі марки тестувалися наосліп і паралельно. Для всіх марок вимірювали глибину агару, рН і концентрацію п'яти катіонів (Mg, Ca, Zn, Mn, Fe).

Кожній марці була дана загальна оцінка, заснована на тому, як середні значення (30 на агар) з триразових тестів співвідносилися з відповідними критеріями контролю якості в таблицях контролю якості EUCAST. Агару Мюллера-Хінтона ІІ Biolife продемонстрував відмінну продуктивність: 99% показань діаметра зони знаходилися в межах QC-діапазону і 81% - на цільовому ±1 мм.

Обмеження методу

• EUCAST оцінив дискову ефективність для 16 стратегічно важливих дисків з антибіотиками від дев'яти виробників дисків для тестування чутливості до протимікробних препаратів. Дослідження виявило деякі хороші і деякі погані якості серед дисків і виробників. Лабораторії несуть відповідальність за здійснення контролю якості, щоб гарантувати, що використовуваний матеріал відповідає стандартам лабораторії і системи охорони здоров'я.18
• Неправильна концентрація інокуляту, неправильне зберігання антимікробних дисків, неправильне зберігання планшетів, що призводить до того, що глибина агару і рН виходять за рамки специфікацій, надмірна вологість, неправильне вимірювання кінцевих точок можуть привести до неправильних результатів.19,20 Тому для забезпечення надійних результатів потрібно суворе дотримання протоколу.
• Тестування чутливості колістину до протимікробних препаратів було пов'язане з труднощами. Спільний підкомітет EUCAST і CLSI випустив рекомендації, які підтверджують, що метод мікророзведень в бульйоні досі є єдиним допустимим методом і що дискова дифузія не працює через погану дифузію великої молекули колістина 21.
• Бактерії, які потребують тиміну або тимідину, можуть не рости задовільно на Агарі Мюллера-Хінтона II через низький рівень тиміну або тимідину.22
• Агар Мюллера-Хінтона II не підходить для аналізу диско-дифузійним методом з повільно зростаючими організмами, анаеробами і капнофілами.20
• Зверніться до документів EUCAST та / або CLSI для отримання детальної інформації про методологію дискової дифузії, читання та інтерпретації зон інгібування, попередження, керівні документи з тестування сприйнятливості, посібники з виявлення механізмів резистентності, клінічних точках зупинки.
• Агар Мюллера-Хінтона II може бути використаний для визначення Мінімальних інгібуючих концентрацій (МІС) за допомогою смужок, що містять антимікробні градієнти. Для виконання цього методу необхідно слідувати інструкціям по застосуванню постачальника смужок і підтвердити процедуру роботи в лабораторії.
• Дане живильне середовище призначене в якості допоміжного засобу при лікуванні інфекційних захворювань; інтерпретація результатів повинна проводитися з урахуванням клінічного анамнезу пацієнта, походження зразка і результатів інших діагностичних тестів.

Запобіжні заходи та попередження

• Агар Мюллера-Хінтона II -це якісна діагностика in vitro, призначена тільки для професійного використання; він повинен
використовуватися належним чином навченим і кваліфікованим лабораторним персоналом з дотриманням затверджених запобіжних заходів щодо біологічної небезпеки і асептичних методів.
• Агар Мюллера-Хінтона II не класифікується як небезпечний відповідно до чинного європейського законодавства.
• Це живильне середовище містить сировину тваринного походження. Попередній і посмертний контроль тварин, а також контроль під час циклу виробництва і розподілу сировини не може повністю гарантувати, що ці продукти не містять будь-яких трансмісивних патогенів. Тому рекомендується, щоб готові до застосування планшети оброблялися як потенційно інфекційні і оброблялися з дотриманням звичайних специфічних запобіжних заходів: не ковтати, не вдихати і не допускати контакту зі шкірою, очима, слизовими оболонками. Завантажте заяву TSE з веб-сайту www.biolifeitaliana.it, описуючи заходи, що здійснюються компанією Biolife Italiana S. r. l. для зниження ризику, пов'язаного з інфекційними захворюваннями тварин.
• Всі лабораторні зразки повинні вважатися інфекційними.
• Кожний планшет цього живильного середовища призначений тільки для одноразового використання.
• Готові до використання планшети не повинні розглядатися як "стерильний продукт", оскільки вони не підлягають термінальній стерилізації, а є продуктом з контрольованим біозабрудненням в межах певних специфікацій, зазначених у сертифікаті контролю якості
• Стерилізуйте всі біологічно небезпечні відходи перед утилізацією. Утилізуйте невикористане середовище та планшети, інокульовані зразками або штамами мікроорганізмів, відповідно до чинного місцевого законодавства.
• Лабораторна зона повинна контролюватися таким чином, щоб уникнути забруднень, таких як живильне середовище або мікробні агенти.
• Сертифікати аналізу та Паспорт безпеки доступні на веб-сайті www.biolifeitaliana.it.
• Інформація, представлена в цьому документі, була визначена в міру наших знань і можливостей і являє собою керівництво по правильному використанню продукту, але без будь-яких зобов'язань або відповідальності. У всіх випадках повинні дотримуватися існуючі місцеві закони, правила і стандартні процедури для дослідження проб, взятих з органічних районів проживання людини і тварин, проб навколишнього середовища і продуктів, призначених для споживання людиною або тваринами. Наша інформація не звільняє наших клієнтів від відповідальності за перевірку придатності нашого продукту за призначенням.